#26 - 02/2023

η γονιδιακή επεξεργασία CRISPR σε ανθρώπινα έμβρυα προκαλεί χρωμοσωμικό χάος

Τρεις μελέτες που δείχνουν μεγάλες διαγραφές και ανακατατάξεις DNA αυξάνουν τις ανησυχίες για την ασφάλεια σχετικά με την επεξεργασία του κληρονομικού γονιδιώματος.

Μια σειρά πειραμάτων που χρησιμοποιούν το εργαλείο γονιδιακής επεξεργασίας CRISPR-Cas9 για την τροποποίηση ανθρώπινων εμβρύων αποκάλυψε πώς η διαδικασία μπορεί να επιφέρει μεγάλες, ανεπιθύμητες αλλαγές στο γονιδίωμα στο σημείο-στόχο ή κοντά σε αυτό.

Οι μελέτες δημοσιεύθηκαν αυτόν τον μήνα στον server προδημοσιεύσεων bioRxiv και δεν έχουν ακόμη αξιολογηθεί από ομότιμους [peer review]. Αλλά όλες μαζί, δίνουν στους επιστήμονες μια καλή ματιά σε αυτό που κάποιοι λένε ότι είναι ένας υποτιμημένος κίνδυνος της επεξεργασίας CRISPR-Cas9. Προηγούμενα πειράματα έχουν αποκαλύψει ότι το εργαλείο μπορεί να προκαλέσει γονιδιακές μεταλλάξεις «εκτός στόχου» μακριά από το σημείο-στόχο, αλλά οι κοντινές αλλαγές που εντοπίστηκαν στις τελευταίες μελέτες μπορεί να διαφύγουν από τις συνήθεις μεθόδους αξιολόγησης.
«Οι επιπτώσεις πάνω στον στόχο είναι πιο σημαντικές και θα ήταν πολύ πιο δύσκολο να εξαλειφθούν», λέει ο Gaetan Burgio, γενετιστής στο εθνικό πανεπιστήμιο της Αυστραλίας στην Καμπέρα.

Αυτές οι ανησυχίες για την ασφάλεια είναι πιθανό να επηρεάσουν τη συνεχιζόμενη συζήτηση σχετικά με το αν οι επιστήμονες θα πρέπει να επεξεργάζονται ανθρώπινα έμβρυα για την πρόληψη γενετικών ασθενειών - μια διαδικασία που είναι αμφιλεγόμενη επειδή δημιουργεί μια μόνιμη αλλαγή στο γονιδίωμα που μπορεί να μεταβιβαστεί από γενιά σε γενιά. «Αν η επεξεργασία ανθρώπινων εμβρύων για αναπαραγωγικούς σκοπούς ή η επεξεργασία της βλαστικής σειράς ήταν διαστημική πτήση, τα νέα δεδομένα ισοδυναμούν με έκρηξη του πυραύλου στην εξέδρα εκτόξευσης πριν από την απογείωση», λέει ο Fyodor Urnov, ο οποίος μελετά την επεξεργασία του γονιδιώματος στο πανεπιστήμιο της Καλιφόρνιας στο Μπέρκλεϊ, αλλά δεν συμμετείχε σε καμία από τις τελευταίες έρευνες.

Ανεπιθύμητα αποτελέσματα

Οι ερευνητές έκαναν τα πρώτα πειράματα με τη χρήση του CRISPR για την επεξεργασία ανθρώπινων εμβρύων το 2015. Έκτοτε, μια χούφτα ομάδες σε όλο τον κόσμο έχουν αρχίσει να διερευνούν τη διαδικασία, η οποία αποσκοπεί στην ακριβή επεξεργασία των γονιδίων. Αλλά τέτοιες μελέτες εξακολουθούν να είναι σπάνιες και γενικά υπόκεινται σε αυστηρές ρυθμίσεις.
Η τελευταία έρευνα υπογραμμίζει πόσο λίγα είναι γνωστά για το πώς τα ανθρώπινα έμβρυα επιδιορθώνουν το DNA που κόβεται από τα εργαλεία επεξεργασίας γονιδιώματος - ένα βασικό βήμα στην επεξεργασία CRISPR-Cas9, λέει η βιολόγος αναπαραγωγής Mary Herbert από το βρετανικό πανεπιστήμιο του Newcastle. «Χρειαζόμαστε έναν βασικό οδικό χάρτη για το τι συμβαίνει εκεί μέσα πριν αρχίσουμε να το χτυπάμε με ένζυμα που κόβουν το DNA», λέει η ίδια.
Η πρώτη προδημοσίευση αναρτήθηκε στο διαδίκτυο στις 5 Ιουνίου από την αναπτυξιακή βιολόγο Kathy Niakan του Ινστιτούτου Francis Crick στο Λονδίνο και τους συναδέλφους της. Στην εν λόγω μελέτη οι ερευνητές χρησιμοποίησαν το CRISPR-Cas9 για να δημιουργήσουν μεταλλάξεις στο γονίδιο POU5F1, το οποίο είναι σημαντικό για την εμβρυϊκή ανάπτυξη. Από τα 18 γονιδιακά τροποποιημένα έμβρυα, περίπου το 22% περιείχε ανεπιθύμητες αλλαγές που επηρέαζαν μεγάλες εκτάσεις του DNA που περιβάλλει το POU5F1. Περιελάμβαναν αναδιατάξεις DNA και μεγάλες διαγραφές αρκετών χιλιάδων γραμμάτων DNA - πολύ μεγαλύτερες από αυτές που συνήθως επιδιώκουν οι ερευνητές που χρησιμοποιούν αυτή την προσέγγιση.

Μια άλλη ομάδα, με επικεφαλής τον βιολόγο βλαστοκυττάρων Dieter Egli του πανεπιστημίου Κολούμπια της Νέας Υόρκης, μελέτησε έμβρυα που δημιουργήθηκαν με σπέρμα που έφερε μια μετάλλαξη που προκαλεί τύφλωση σε ένα γονίδιο που ονομάζεται EYS. Η ομάδα χρησιμοποίησε το CRISPR-Cas9 για να προσπαθήσει να διορθώσει αυτή τη μετάλλαξη, αλλά περίπου τα μισά από τα έμβρυα που εξετάστηκαν έχασαν μεγάλα τμήματα του χρωμοσώματος - και μερικές φορές ολόκληρο το χρωμόσωμα - στο οποίο βρίσκεται το EYS.

Και μια τρίτη ομάδα, με επικεφαλής τον αναπαραγωγικό βιολόγο Shoukhrat Mitalipov του πανεπιστημίου υγείας και επιστήμης του Όρεγκον στο Πόρτλαντ, μελέτησε έμβρυα που δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας σπέρμα με μετάλλαξη που προκαλεί καρδιακή πάθηση. Αυτή η ομάδα βρήκε επίσης ενδείξεις ότι η επεξεργασία επηρέασε μεγάλες περιοχές του χρωμοσώματος που περιέχει το μεταλλαγμένο γονίδιο.

Σε όλες τις μελέτες, οι ερευνητές χρησιμοποίησαν τα έμβρυα μόνο για επιστημονικούς σκοπούς και όχι για τη δημιουργία εγκυμοσύνης. Οι επικεφαλής συγγραφείς των τριών προδημοσιεύσεων αρνήθηκαν να συζητήσουν τις λεπτομέρειες της εργασίας τους με την ειδησεογραφική ομάδα του Nature έως ότου τα άρθρα δημοσιευθούν σε επιστημονικά περιοδικά με κριτές.

Μη προβλέψιμη επισκευή

Οι αλλαγές είναι το αποτέλεσμα των διαδικασιών επιδιόρθωσης του DNA που αξιοποιούνται από τα εργαλεία επεξεργασίας γονιδιώματος. Το CRISPR-Cas9 χρησιμοποιεί μια μικρή αλυσίδα RNA για να κατευθύνει το ένζυμο Cas9 σε μια θέση στο γονιδίωμα με παρόμοια αλληλουχία. Στη συνέχεια, το ένζυμο κόβει και τις δύο αλυσίδες του DNA σε αυτό το σημείο και τα συστήματα επιδιόρθωσης του κυττάρου επουλώνουν το κενό.

Οι επεξεργασίες συμβαίνουν κατά τη διάρκεια αυτής της επιδιόρθωσης: τις περισσότερες φορές, το κύτταρο σφραγίζει την τομή χρησιμοποιώντας έναν μηχανισμό επιρρεπή σε σφάλματα που μπορεί να εισάγει ή να διαγράψει έναν μικρό αριθμό γραμμάτων DNA. Εάν οι ερευνητές παρέχουν ένα πρότυπο DNA, το κύτταρο μπορεί μερικές φορές να χρησιμοποιήσει αυτή την αλληλουχία για να επιδιορθώσει την τομή, με αποτέλεσμα μια πραγματική επανεγγραφή. Αλλά το σπασμένο DNA μπορεί επίσης να προκαλέσει ανακάτεμα ή απώλεια μιας μεγάλης περιοχής του χρωμοσώματος.

Προηγούμενες εργασίες με τη χρήση του CRISPR σε έμβρυα ποντικιών και άλλα είδη ανθρώπινων κυττάρων είχαν ήδη δείξει ότι η επεξεργασία χρωμοσωμάτων μπορεί να προκαλέσει μεγάλες, ανεπιθύμητες επιδράσεις. Αλλά ήταν σημαντικό να καταδειχθεί η εργασία και σε ανθρώπινα έμβρυα, λέει ο Urnov, επειδή διαφορετικοί τύποι κυττάρων μπορεί να αντιδράσουν διαφορετικά στην επεξεργασία του γονιδιώματος.

Τέτοιες αναδιατάξεις θα μπορούσαν να διαφύγουν σε πολλά πειράματα, τα οποία συνήθως αναζητούν άλλες ανεπιθύμητες αλλαγές, όπως αλλαγές ενός γράμματος DNA ή μικρές εισαγωγές ή διαγραφές λίγων μόνο γραμμάτων. Οι τελευταίες μελέτες, ωστόσο, έψαξαν ειδικά για μεγάλες διαγραφές και χρωμοσωμικές αναδιατάξεις κοντά στο σημείο-στόχο. «Αυτό είναι κάτι που όλοι μας στην επιστημονική κοινότητα θα λάβουμε, αρχής γενομένης από τώρα, πιο σοβαρά υπόψη από ό,τι έχουμε ήδη λάβει», λέει ο Urnov. «Δεν πρόκειται για ένα τυχαίο περιστατικό της μιας φοράς».

Γενετικές αλλαγές

Οι τρεις μελέτες προσέφεραν διαφορετικές εξηγήσεις για το πώς προέκυψαν οι αλλαγές στο DNA. Οι ομάδες των Egli και Niakan απέδωσαν το μεγαλύτερο μέρος των αλλαγών που παρατηρήθηκαν στα έμβρυά τους σε μεγάλες διαγραφές και αναδιατάξεις. Η ομάδα του Mitalipov αντίθετα δήλωσε ότι έως και το 40% των αλλαγών που διαπίστωσε προκλήθηκαν από ένα φαινόμενο που ονομάζεται γονιδιακή μετατροπή, κατά το οποίο οι διαδικασίες επιδιόρθωσης του DNA αντιγράφουν μια αλληλουχία από το ένα χρωμόσωμα ενός ζεύγους για να θεραπεύσουν το άλλο.

Ο Mitalipov και οι συνάδελφοί του ανέφεραν παρόμοια ευρήματα το 2017, αλλά ορισμένοι ερευνητές ήταν επιφυλακτικοί ως προς το ότι οι συχνές γονιδιακές μετατροπές θα μπορούσαν να συμβούν σε έμβρυα. Σημείωσαν ότι τα μητρικά και τα πατρικά χρωμοσώματα δεν βρίσκονται το ένα δίπλα στο άλλο τη στιγμή που υποτίθεται ότι συμβαίνει η γονιδιακή μετατροπή και ότι οι δοκιμασίες που χρησιμοποίησε η ομάδα για τον εντοπισμό των γονιδιακών μετατροπών θα μπορούσαν να έχουν εντοπίσει άλλες χρωμοσωμικές αλλαγές, συμπεριλαμβανομένων των διαγραφών.

Ο Egli και οι συνεργάτες του εξέτασαν άμεσα για γονιδιακές μετατροπές στην τελευταία τους προδημοσίευση και απέτυχαν να τις βρουν, και ο Burgio επισημαίνει ότι οι δοκιμασίες που χρησιμοποιήθηκαν στην προδημοσίευση του Mitalipov είναι παρόμοιες με αυτές που χρησιμοποίησε η ομάδα το 2017. Μια πιθανότητα είναι ότι τα σπασίματα του DNA επουλώνονται διαφορετικά σε διάφορες θέσεις κατά μήκος του χρωμοσώματος, λέει ο Jin-Soo Kim, γενετιστής στο Εθνικό Πανεπιστήμιο της Σεούλ και συν-συγγραφέας της προδημοσίευσης του Mitalipov.

Τίτλος πρωτότυπου: «CRISPR gene editing in human embryos wreaks chromosomal mayhem»
Πηγή: https://www.nature.com/articles/d41586-020-01906-4
Μετάφραση: Harry Tuttle